焦虑|江南大学发明专利申请：新型生物保藏技术及其在抑郁症治疗中的应用

(19) 国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (10) 申请公开号 (43) 申请公开日期 (21) 申请号.3 (22) 申请日期 2022.07.14 (83) 生物保存信息：.10.16 ( 71）申请人江南大学地址为江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号（72号）。明仁 刘晓明 赵建新 余鹏 杨波 陈海琴 崔树茂 陈伟 (74) 专利代理机构 哈尔滨阳光汇源知识产权代理有限公司 23211 专利代理人 赵巧娜 (51) Int.Cl.C12N1/20 (2006.01) C12N1 /04(2006.01)/744(2015.01 )/22(2006.01)/24(2006.01)/28(2006.01)A61P1/00(2006.01)/135( 2016.01)/00(2016.01)/50(2021.01)/60(2021.01)A23C9/123(2006.01)/032(2006.01)C12R1/46(2006.01)(54) 发明名称 一种嗜热链球菌发酵产物的制备方法和缓解焦虑功能(57) 摘要本发明公开了一种具有焦虑焦虑的嗜热链球菌发酵产物。一种链球菌热发酵产品的制备方法，属于食品加工发酵技术领域。

本发明应用食品级安全菌株嗜热链球菌60810来制备提高宿主血清中血清素水平的产品，安全健康。嗜热链球菌60810可以显着提高血清中的血清素水平。它可以在与血清素变化相关的认知和记忆障碍疾病中发挥其调节作用，还可以显着促进肠道内双歧杆菌的丰度。对胃肠液有良好的耐受性，能有效地发挥抗病作用。其对胃肠道的益生菌作用。嗜热链球菌60810发酵的乳制品中乙偶姻含量较高，增强了乳制品的风味。本发明将嗜热链球菌60810应用于发酵制品的制备，对于多元化功能性乳制品的开发具有重要意义。权利要求1页，序列表12页，附图2页，4页。 04.一株嗜热链球菌(hilus)，其特征在于，该嗜热链球菌保藏于2019年10月16日。广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为.60810。 2.一种菌剂，其特征在于，所述发酵剂的制备方法为：S1． 2.根据权利要求1所述的嗜热链球菌，将其细菌活化，得到活化液； S2、将活化液接种于培养基中，30-40℃培养15-20小时，得到菌液； S3、将得到的菌液离心，取沉淀，得到菌泥。 ; S4。将菌泥洗净，用冻干保护剂重悬至菌浓度不低于1×/mL，得到菌悬液； S5。将菌悬液预培养，然后冷冻干燥，得到含有权利要求1所述的嗜热链球菌菌剂的嗜热菌菌悬液。

3.根据权利要求1所述的嗜热链球菌或根据权利要求2所述的细菌制剂在制备用于增加血清素水平的产品中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品具有(a)至(c)所示的一种或多种功能： (a)缓解焦虑和抑郁； (b) 增强认知能力并减少记忆障碍； (c) 调节肠胃功能，增加肠道内双歧杆菌的丰度。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于食品和药品。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。 7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品包含通过权利要求1所述的嗜热链球菌或权利要求2所述的菌剂发酵获得的发酵产物，或者含有权利要求1所述的产物的含有嗜热链球菌的食品。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵制品包括酸奶、奶酪、发酵豆奶。 9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含有权利要求1所述的嗜热链球菌的食品包括巧克力、水果和蔬菜制品。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的嗜热链球菌添加到巧克力或果蔬产品的制备中。权利要求第1/1页 一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵制品的制备方法 技术领域 [0001] 本发明涉及一种具有缓解焦虑功能的嗜热链球菌发酵制品的制备方法，属于食品领域加工和发酵技术领域。

背景技术 [0002] 随着居民生活条件的改善，消费者对食品的需求也在不断升级，其中营养健康元素是大多数人关注的焦点。发酵乳是由牛奶经乳酸菌发酵而成，是补充蛋白质、矿物质等营养物质的有效途径。然而，目前市售发酵乳产品严重的同质化问题已逐渐成为影响乳制品企业发展的问题之一。功能性乳制品的兴起改变了这一现状。由于它满足了消费者对健康生活方式的追求，受到了强烈关注，成为乳制品企业竞争的热点。 [0003]焦虑障碍，也称为焦虑神经症，是神经症总类别中最常见的疾病类型，其特征是体验焦虑情绪。尤其是以“高学历、高收入、高压力”为主要特征的城市新“三高”精英群体，成为焦虑氛围的主要主体。抑郁、失眠、便秘等症状都体现在这些人群中。更明显。在其发病机制的研究中，谷氨酸、5-羟色胺、多巴胺等神经递质系统的功能和代谢异常是焦虑症研究的重点。其中，血清素是大脑中重要的单胺类神经递质。作为连接肠道微生物与大脑的重要信号分子，在调节神经系统、胃肠功能、体内脂质代谢、免疫系统等方面发挥着重要作用。研究表明，血清素是产生愉快情绪的信使。它可以调节情绪和精力。大多数抑郁药物通过增加血清素水平发挥作用。目前市场上常见的抑郁药物大多作用于血清素，以维持和升高大脑中的血清素水平，如阿米替林、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、文拉法辛、度洛西汀等，但长期使用抑郁有一定的副作用。副作用，如出汗、肠胃不适、体重增加、失眠、疲劳、紧张、肌肉震颤和抑郁。

[0004] 认知障碍是一类主要影响学习、记忆、感知和问题解决的心理健康状况，包括健忘症、痴呆和谵妄。还包括与影响认知和记忆功能的焦虑症、情绪障碍和精神障碍相关的认知症状。记忆障碍的特征是神经解剖结构损伤导致的障碍，阻碍了记忆的存储、保留和回忆。记忆障碍可能是进行性的，包括阿尔茨海默病，也可能是直接的，包括头部受伤引起的疾病。同时，随着生活和学习压力增大，加上睡眠质量不佳，很多人的记忆力开始下降。因此，如何提高记忆力成为很多人关心的问题。 [0005] 鉴于药物治疗的缺点，寻找健康有效的针对抑郁、焦虑、认知障碍的干预或治疗途径具有重要意义。近年来的研究表明，血清素对身体的作用可能会受到肠道微生物的影响。肠道中的某些微生物具有产生血清素的能力。同时，微生物群及其代谢物（如丁酸）可以通过影响色氨酸羟化酶活性或色氨酸的代谢命运来调节人体的血清素水平。血清素作为连接肠道微生物和大脑的重要信号分子，在调节神经系统、胃肠功能、体内脂肪代谢和免疫系统等方面发挥着重要作用。研究表明，生物活性营养素和肠道微生物群可以通过多种机制改变 DNA 甲基化和组蛋白谱，而人类肠道中的微生物可能在调节脑轴的各种元件中发挥重要作用。

目前，一些双歧杆菌和乳酸杆菌可以调节神经功能：一项专利公开了一种可以增加大脑中神经递质5-羟色胺含量的鼠李糖乳杆菌菌株，一项专利公开了一种可以提高大脑中神经递质5-羟色胺含量的菌株，手册1/12页3CN A3罗伊氏乳杆菌可增加大鼠外周血中神经递质 5-羟色胺的水平。该专利公开了一种短双歧杆菌菌株，可以提高阿尔茨海默氏症小鼠血清中5-羟色胺的水平。 ，该专利中公开了一种乳酸乳球菌菌株，可以增加中枢5-羟色胺水平。嗜热链球菌是乳品工业发展的重要发酵菌株之一。嗜热链球菌的研究主要集中在其发酵特性上，如其对发酵乳产酸、风味形成和质构特性的影响。如果能够进一步发掘嗜热链球菌的新特性并将其应用于发酵产品中，将具有广阔的应用和市场前景。发明内容 [0007] 发明人从我国青海西宁采集的牦牛曲拉中筛选出一株嗜热链球菌。该菌株能显着提高宿主血清中的血清素水平，同时增加粪便中双歧杆菌的数量。该菌株能很好地耐受人体胃液和肠液，在脱脂牛奶中生长良好，并产生挥发性风味物质乙醛和乙偶姻，为后续发酵食品的制备奠定了良好的基础。有助于增强食物的风味。

本发明的第一个目的是提供一株嗜热链球菌（ ），已于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC第60810号，保藏地址广州市先烈中路100号59栋5楼。 [0009] 在一种实施方式中，所述嗜热链球菌GDMCC No. 60810菌株具有以下特性： [0010] (1)该菌株能够显着提高宿主血清中的血清素水平； [0011] (2)该菌株能够显着促进肠道内双歧杆菌的丰度； [0012] (3)该菌株具有良好的胃肠道耐受性和体内增殖能力。 [0013]本发明的第二个目的是提供一种含有嗜热链球菌60810的菌剂。 [0014]在一个实施例中，所述菌剂的制备方法为: [0015]S1．根据权利要求1所述连续激活嗜热链球菌两代，得到激活液； [0016] S2。活化 将液体接种到培养基中，30～40℃培养15～20小时，得到菌液； [0017] S3、将得到的菌液离心，取沉淀，得到菌泥； [0018] S4。将菌泥用生理盐水洗涤3次，然后用冻干保护剂重悬至菌浓度不低于1×/mL，即得菌泥。暂停; [0019] S5.将菌悬液在37℃预培养60分钟，然后冷冻干燥，得到含有嗜热链球菌的菌剂。

[0020] 在一种实施方式中，所述保护剂的成分包括130g/L脱脂奶粉。 [0021] 本发明的第三个目的是提供一种能够提高血清素水平的产品，具体是提高血清中血清素的含量。该产品是利用所述嗜热链球菌GDMCC No.60810或上述菌剂制备而成。 [0022] 在一个实施例中，所述产品具有如(a)至(c)所示的一种或多种功能： [0023] (a)缓解焦虑和抑郁； [0024] (b)增强认知并缓解记忆障碍； [0025] (c)调节胃肠功能并增加肠道内双歧杆菌的丰度。 [0026] 在一种实施方式中，产品包括但不限于食品和药品。 [0027] 在一种实施方式中，所述药物的剂型包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。在一个实施例中，所述胶囊的制备方法为：说明书2/12页4CN A4 [0029] S1，将嗜热链球菌GDMCC No.60810划线于M17乳糖固体培养基上，37℃培养48h，得单一菌落； [0030] S2。挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h活化，连续活化两代，得到活化液； [0031] S3、将活化液以2% (v/v)的接种量接种到培养基中，37°C培养。培养18h，得到菌液；将菌液8000g离心10分钟，得到菌泥； [0032] S4。将菌泥用生理盐水洗涤3次，然后用保护剂重悬至浓度为1×/mL，得到菌悬液 [0033] S5，将菌悬液加入到浓度为30g/mL的海藻酸钠溶液中。 L直至浓度为2×/mL，然后充分搅拌，使嗜热链球菌GDMCC 60810号细胞均匀分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液 解决方案; [0034] S6。将混合液挤出至浓度为20g/L的氯化钙溶液中，形成胶体颗粒；待形成的胶体颗粒静态固化30分钟后，过滤收集胶体颗粒； [0035] S7、将收集到的胶体颗粒冷冻干燥48小时，得到粉末；将粉末装入药用胶囊中，即得胶囊产品。

[0036] 在一种实施方式中，片剂还含有填充剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增溶剂和甜味剂。 [0037] 优选地，所述填充剂为淀粉，所述粘合剂包括羧甲基淀粉钠，所述润滑剂包括滑石粉，所述增溶剂和甜味剂包括蔗糖，所述稀释剂和粘合剂的混合物包括纤维素衍生物。更优选地，称取嗜热链球菌GDMCC No.60810菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份，水1.0重量份，得原料；将原料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用压片机压片，然后用药品干燥机干燥，得到片剂。在一个实施方案中，食品包括通过发酵嗜热链球菌GDMCC No.60810或权利要求1食品的含有嗜热链球菌的菌剂或产品获得的发酵产品。 [0040] 在一种实施方式中，发酵产品包括酸奶、奶酪和发酵豆奶。优选的，所述酸奶的制备方法是以牛奶为原料，将嗜热链球菌GDMCC No.60810或含有嗜热链球菌GDMCC No.60810的冻干发酵剂均质、冷却，在42℃下发酵12小时。 ，发酵至pH 4.50~4.70。

[0042] 优选地，所述奶酪的制备方法为: [0043] S1．将均质灭菌后的牛奶冷却至40℃，加入其重量的0.01%-0.1%菌剂和0.003%-0.005%CaCl2，充分搅拌30分钟，然后在40℃温度下发酵发酵30-60分钟，得到发酵乳； [0044] S2。将其重量的0.2-2.5添加到发酵乳中。 %的1%凝乳酶液，充分搅拌后，静置30-45min，得到凝乳； [0045] S3。当凝乳的pH值为4.5-5时，将凝乳放入60目滤布槽中沥干乳清，得到干酪半成品；将其在4-8°C的温度下放置18-20小时以制作奶酪。 [0046] 优选地，所述发酵豆浆的制备方法为： [0047] S1．将干黄豆磨碎煮熟，用120目纱布过滤，即得豆浆； [0048] S2。将豆浆高温灭菌，冷却至室温；说明书 3/12 页 5CN A5 [0049] S3。将嗜热链球菌GDMCC No.60810加入豆浆中，使豆浆中嗜热链球菌GDMCC No.60810活菌数达到/g，将接种后的样品置于37℃培养箱中发酵。发酵完成后，豆浆需要冷藏在4℃。 [0050] 在一种实施方式中，含有嗜热链球菌GDMCC No. 60810的食品包括巧克力、水果和蔬菜产品。

[0051] 优选地，所述果蔬饮料的制备方法为： [0052] S1．将果蔬压榨，除去残渣，得到果蔬汁； [0053] S2。将果蔬汁灭菌后冷却至37℃； [0054]S3。将嗜热链球菌GDMCC No.60810加入灭菌后的果蔬汁中，浓度不低于1×/mL，得到果蔬饮料。 [0055] 优选地，所述巧克力的制备方法为: [0056] S1．将可可块和白砂糖按质量比1:1～1:3混合，然后加热，搅拌均匀，得到巧克力融化物； [0057] S2.加入乳化剂（液体卵磷脂、大豆磷脂、山梨糖醇单月桂酸酯）和嗜热链球菌.60810菌粉混合均匀，乳化剂：菌粉质量比=80~90:10~20，然后磨细，酸化，脱水、结晶、调温，最后选择合适的型号进行浇铸，得到巧克力。 [0058] 本发明的有益效果是: [0059] 1、本发明将食品级安全菌株嗜热链球菌GDMCC No. 60810应用于制备提高宿主血清中血清素水平的产品，即安全、健康。 2、本发明的嗜热链球菌GDMCC No.60810可显着提高血清中的血清素水平，从0.47mg/L升高至3.6mg/L，升高倍数达到6.7倍，使其随血清素变化。对认知和记忆障碍相关疾病发挥调节作用，还能显着促进肠道内双歧杆菌的丰度；嗜热链球菌GDMCC No.60810具有良好的胃肠耐受性和内部增殖能力，能在胃肠道有效发挥其益生作用。

3、本发明的嗜热链球菌GDMCC No.60810脱脂乳菌株在奶系统发酵中具有良好的生长能力和产酸能力；该菌株能显着提高发酵乳制品中乙偶姻的含量，增强奶油味。 ，增强发酵食品的风味。 [0062] 4、本发明的嗜热链球菌GDMCC No. 60810发酵的具有缓解焦虑功能的乳制品，对于开发多样化的功能性乳制品具有重要意义。 [0063] 生物材料的保存 [0064] 乳酸乳球菌亚种。本发明提供的 (subsp.)，分类学名称为subsp.，于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60810，保藏地址为59号楼5楼, 广州市先烈中路100号附图说明 [0065] 图1为嗜热链球菌GDMCC No. 60810在M17固体培养基上的菌落照片； [0066] 图2为嗜热链球菌GDMCC No. 60810菌株革兰染色在1000倍显微镜下的观察照片；说明书4/12第6CN A6页 [0067] 图3显示嗜热链球菌GDMCC No.60810改善小鼠血清中血清素的变化； [0068] 图4为嗜热链球菌GDMCC No.60810促进小鼠粪便中双歧杆菌的情况； [0069] 图5为GDMCC No. 60810的嗜热链球菌胃肠道耐受性评价及体内增殖情况； [0070] 图6为嗜热链球菌GDMCC No. 60810在脱脂乳发酵中的生长情况； [0071] 图7为嗜热链球菌GDMCC No.60810在脱脂乳发酵中的产酸情况； [0072] 图8为嗜热链球菌GDMCC No.60810的产酸情况，发酵后脱脂乳中挥发性物质的含量。

具体实施方式 [0073] 下面结合附图描述的实施例对本发明进行详细说明，所有附图中相同的标号表示相同的特征。尽管附图中示出了本发明的具体实施例，但是应当理解，本发明可以以各种形式来实施并且不应当限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了提供对本发明的透彻理解，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。 [0074] 除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是合适的方法和材料的以下实施例仅是说明性的并且不限制本发明。 [0075] 其次，本文使用的“一个实施例”或“一个实施例”指的是可以包括在本发明的至少一个实现中的特定特征、结构或特性。 [0076] 如本文所用，术语“菌株”是指具有共同特征的特定微生物物种。除非另有说明，术语“菌株”和“细胞”在本文中可互换使用。本文使用的术语“平板”是指平板培养基，其是用于获得微生物纯培养物的最常用的固体培养基形式。它是在无菌培养皿中将固体培养基冷却固化而形成的培养物。基础实体平面通常简称为培养板或平板。

[0078] 本文使用的术语“培养基”是指包含微生物生长所需的化学元素以及至少一种碳源和一种氮源的培养基。 M17液体培养基：(1L)：大豆蛋白胨5.0g、蛋白胨2.5g、酪蛋白胨2.5g、酵母浸膏粉2.5g、牛肉浸膏粉5.0g、乳糖5.0g、抗坏血酸钠0.5g、β-甘油磷酸钠19.0 g、硫酸镁0.25g、pH值7.2±0.2。添加蒸馏水以完全溶解溶液并保持pH值在6.8至7.2之间。 115°C 灭菌 20 分钟。 [0080] M17固体培养基:按照M17液体培养基配制，然后加入18g琼脂粉。 115°C 灭菌 20 分钟。 [0081] 雄性C57BL/6小鼠：购自北京维通利华公司。 [0082] 对照菌株LMD9:购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的市售发酵剂。有文献报道LMD9在体内具有一定的定植能力，在体内具有一定的调节作用。因此，LMD9被用作对照菌株来研究嗜热链球菌的宿主调节。实施例1：嗜热链球菌GDMCC No.60810菌株分离鉴定方法 [0084] (1)制备合适的样品稀释梯度并培养 [0085] 产自青海西宁地区的牦牛曲，保存于-80°C冰箱中取出并放在冰上解冻。摇匀混匀后，取0.5mL样品加入4.5mL无菌生理盐水中，完成10倍稀释。摇匀混匀后，取出0.5mL稀释液加入4.5mL无菌生理盐水中，完成第二次稀释，每次10次，以此类推，直至稀释度达到10-6。每个梯度稀释液取100 μL，均匀铺在M17固体培养基板上，倒置，置于37℃。使用说明 5/12 Page 7CN A7厌氧培养36～48小时，及时观察。

[0087] (2)划线分离纯化 [0087] 取出已生长有细菌菌落的平板后，选择单菌落明显的梯度平板，挑出菌落形状不同的菌落，进行二次划线，直至所有单菌落全部分离。纯化的。殖民地。 [0089] (3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验 [0089]挑取载玻片上的单个菌落，进行涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后，进行显微镜检查并记录革兰氏染色结果（见图2）；挑取载玻片上的单菌落，加入3%过氧化氢溶液，观察是否有气泡，记录过氧化氢酶接触结果。 [0090] (4)菌株保存 [0091] 挑取纯化后的各菌株单菌落至5mL液体M17培养基中，置于37°C厌氧条件下静态培养20?24小时，吸干1 mL 菌液。转移至无菌管中，离心3分钟，弃上清，加入1mL 37%无菌甘油溶液，重悬，-80℃保存。 [0092] (5) 16S rDNA序列扩增 [0093] 取菌液1 mL，离心3分钟，倒出上清，洗涤两次，离心倒出上清，得到菌泥，以此为模板[0094] 1)扩增体系20 μL: [0095]模板量1 μL，双向引物各 1 μL，Taq 酶为 10 μL，ddH2O 为 7 μL。

[0096] 使用的引物是27F:AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA(SEQ ID No 1)和1492R:GGT GTT ACG ACT T(SEQ ID No 2)。 [0097] 扩增片段的长度为。 [0098] 2)扩增条件：[0099]预变性：95°C 3min，[0100]第一步变性：94°C 1min，[0101]第二步退火：60°C 37s，[ [0102]第三步延伸：72°C 2min，[0103]循环数：37 [0104] 第四步最终延伸：72°C 5分钟，[0105]第五步保持：12°C 10分钟。 [0106] (6)琼脂糖凝胶电泳 [0107] 称取80 mL琼脂糖加入锥形瓶中，加入80 mL 1xTAE，微波间歇4 min，至液体澄清透明，稍微冷却，加入4 μL核酸染料，摇匀，无气泡，倒入凝胶板槽中，冷却40分钟固化，然后放入移入电泳槽，除去气泡，依次加入 PCR 扩增产物，每孔加入 2 μL。 PCR 扩增产物在凝胶上以 120V 运行 15 分钟。完成后取出放入凝胶电泳成像仪中拍照并保存。记录成功 PCR 样本的数量，并将成功的 PCR 产物储存在 -20°C 冰箱中。 [0108] (7)测序与鉴定 [0109] PCR成功的样品送英伟杰基(上海)贸易有限公司检测。根据反馈的序列结果，样本上传至美国国家生物技术信息中心（NCBI）序列数据库。在(blast)中进行BLAST搜索，选择匹配度最高的菌株信息记录结果。

经分析鉴定，本发明提供的菌株为嗜热链球菌（ ）。测序结果如下： 说明书第6/12页8CN A8[0110]

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